پایان نامه با موضوع d، دهی، تغییرات، طی

دانلود پایان نامه

ی کل، اندیس DPPH و ORAC داشت (P<0/05). بهترین حلال برای روش ORAC، اتانول اسیدی شده، برای روش DPPH، استون 100% و برای ترکیبات قطبی کل، استون %50 بود. بنابراین ارقام مختلف از مناطق مختلف نیاز دارند که برای مقایسه ی محلول سبوس گندم، محلول کنژوگه و میزان فنول و فعالیت آنتی اکسیدانی شان تجزیه و تحلیل شوند. فصل سوم
مواد و روشها
3-1- مواد اولیه
روغن کانولا بدون آنتی اکسیدان از مجتمع کشت و صنعت شمال تهیه شد و تا زمان انجام آزمایش در سردخانه و دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. زمان گلدهی گیاه هلپه نیز متناسب با شرایط محل رشد بین خرداد و مرداد است و در همین زمان جمع آوری آن شروع می گردد. قسمت مورد استفاده این گیاه سرشاخه گلدار آن است. تمامی مواد شیمیایی مورد استفاده از نوع آزمایشگاهی بوده که شامل موارد زیر می باشد که تمامی آنها از شرکت مرک آلمان خریداری شد:
متانول، هگزانول، کربنات سدیم، اسید گالیک، تولوئن، کلروفوم، هیدروکسی پتاسیم، هیدرو کلرید، آهن کلرید (II)، آمونیوم تیوسیانیت، معرف سیوکالچو، کربنات سدیم، محلول 2، 2- بی پیریدین، آلفا توکوفرول، دی نیترو فنیل هیدرازین (DNPH)، اسید کلریدیک غلیظ، 2- 4 دکا دی انال، تری‌فنیل‌فسفین، هیدرواکسید پتاسیم، یدید پتاسیم، تیوسولفات سدیم، نشاسته، تولوئن، سیلکاژل، فنل فنالئین، پتاس، کاغذ صافی واتمن شماره یک همچنین از بتا کاروتن، لینولئیک اسید و توئین 40 (ساخت شرکت سیگما) استفاده شد. بوتیلیتید هیدروکسی آنیزول (ساخت شرکت TITRAN) به عنوان آنتی اکسیدان استاندارد استفاده شد.

3-2- لوازم آزمایشگاهی
برای انجام آزمایش ها از دستگاههای زیر استفاده گردید:
* ترازوی آزمایشگاهی با دقت 001/0 گرم (ساخت آلمان)
* سانتریفوژ (HERMLE z200A – Germany)
* اسپکتروفتومتر (مدل 2100- VISIBLE UV) (ساخت UNICO)
* آون (مدل IP88) (ساخت شرکت Aria Teb، ایران)
* انکوباتور
* خرد کن (Molinex – 684- French)
* روتاری اواپراتور (TAM 2times – Iran)
* ستگاه رنسیمت مدل (743) (ساخت METROHM)
* شیکر (LABTRON Ls – 100)
* کاغذ صافی (WHATMAN-1)
* سرخ کن (ساخت فرانسه، تفال)

3-3- تهیه و آماده کردن پودر گیاه هلپه
گیاه هلپه (کلپوره همدانی) از منطقه استان فارس در اوایل تابستان سال 1393 تهیه گردید و پس از تمیز کردن قسمت سرشاخه گلدار گیاه، در سایه و در دمای اتاق خشک گردید. بعد از اینکه بطور کامل خشک شدند، توسط خرد کن کاملاً به صورت پودر در آمدند.

3-4- استخراج عصاره (عصاره گیری بوسیله شیکر(ماسراسیون))
در این پژوهش، جهت عصاهگیری از سه حلال آب، اتانول و اتانول – آب (به نسبت 50-50) استفاده کردیم سپس پودر آماده شده گیاه هلپه را با حلالهای (با نسبت 1به 10 وزنی/حجمی) مورد نظر (آب، اتانول و اتانول – آب) مخلوط کرده و دور از نور به مدت 24 ساعت در دمای اتاق در دستگاه شیکر با سرعت rpm 250 قرار داده شد. سپس سه مرحله سانتریفوژ شده (هر بار 10دقیقه و با rpm300) و در هر مرحله فاز آبی (فاز رویی) جمع آوری شد، تا دیگر رسوبی در ته لوله دیده نشود. سپس فازهای آبی جمع آوری شده، با کاغذ صافی واتمن شماره 1 صاف شد. در ادامه توسط روتاری اواپراتور (حداکثر دما 50 درجه سانتی گراد) حلال تبخیر و عصاره گیاه هلپه بدست آمد. عصارههای بدست آمده از سه استخراج حلالی را تا زمان انجام آزمایش در داخل فویل آلومینیمی پیچیده و در دمای 18- درجه سانتی گراد نگهداری شد (اسماعیل زاده کناری و همکاران، 1391).

شکل 3- 1- دستگاه شیکر
3-5- آماده سازی نمونههای روغن
در این تحقیق از روغن بدون آنتیاکسیدان تهیه شده 4 سری نمونه روغن جهت ارزیابی آماده شد.
1- روغن بدون آنتیاکسیدان که به آن ppm 200 از عصاره هلپه استخراج شده با حلال آب اضافه شد.
2- روغن بدون آنتیاکسیدان که به آن ppm 200 از عصاره هلپه استخراج شده با حلال اتانول – آب اضافه شد.
3- روغن بدون آنتیاکسیدان که به آن ppm 200 از عصاره هلپه استخراج شده با حلال اتانول اضافه شد.
4- روغن بدون آنتیاکسیدان که به آن ppm 200 آنتیاکسیدان BHA اضافه شد.
سپس یک نوع نمونه از هرکدام از روغنهای فوق تهیه شد و هر کدام از روغنها در دمای سرخ کردن (180 درجه سانتیگراد) به مدت 30 ساعت حرارت داده شد و هر 5 ساعت از روغنها نمونه برداری انجام شد (آلادنای8 و پیریلسکی، 2011).

3-6- اندازه گیری ترکیبات فنولی
3-6-1- رسم منحنی استاندارد و معادله خط رابطه جذب و غلظت اسید گالیک (منحنی کالیبراسیون)
ابتدا محلول های استاندارد اسید گالیک در متانول با غلظتهای مختلف در دامنه 04/0 تا 7/0 میلی گرم در میلی لیتر آماده شد. سپس به بالن ژوژه های 50 میلی لیتری، 1 میلی لیتر محلول استاندارد اسید گالیک، 5/2 میلی لیتر معرف فولین- سیوکالچو ( برای تهیه این معرف، معرف فولین- سیوکالچو غلیظ با آب مقطر به نسبت 1به 10 رقیق شد) و 5 میلی لیتر سدیم کربنات 5/7 درصد اضافه و با آب خالص به حجم نهایی رسانده شد. محلول در طول شب نگهداری و سپس جذب آن در طول موج 765 نانومتر توسط دستگاه اسپکتوفتومتری خوانده شد. منحنی جذب در برابر غلظت اسید گالیک (میلی گرم به میلی لیتر) رسم و معادله (3-1) با ضریب تبیین 99/0 به دست آمد (شکل 3-2).
معادله (3-1):

در این فرمول X میزان جذب خوانده شده در طول موج 765 نانومتر و Y مقدار اسید گالیک بر حسب میلی گر
م بر میلی لیتر است.

شکل3-2- منحنی استاندارد غلظت اسید گالیک در برابر میزان جذب خوانده شده درطول موج 7?5 نانومتر

3-6-2- اندازهگیری ترکیبات فنولی روغن کانولای بدون آنتیاکسیدان سنتزی
جهت اندازه گیری میزان کل ترکیبات فنولیک 5/2 گرم روغن کانولا فاقد آنتیاکسیدان سنتزی در 5/2 میلی لیتر هگزان نرمال حل و به مدت 1 دقیقه ورتکس شد. سپس 5/2 میلی لیتر محلول متانول – آب (به نسبت 80 : 20 حجمی/ حجمی) اضافه و به مدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. فاز روغنی با سرنگ خارج و به لوله آزمایش دیگر منتقل شد و فاز آبی نیز به صورت جداگانه نگه داشته شد. فاز روغنی جدا شده، به مدت 1 دقیقه ورتکس شد. مرحله استخراج ترکیبات فنولک هیدروفیل سه بار تکرار و در نهایت فازهای هیدرومتانولیک (آبی) در بالن ژوژه 50 میلی لیتری با هم مخلوط شده و پس از افزودن 5/2 میلی لیتر معرف فولین سیوکالچو و 5 میلی لیتر کربنات سدیم 5/7 درصد به آن اضافه و با آب مقطر به حجم50 میلی لیتر رسانده شد. مخلوط به دست آمده را در فویل پیچیده و به مدت 24 ساعت در دمای اتاق و در محل تاریک نگهداری و سپس جذب آن در طول موج 765 نانومتر با استفاده از اسپکتروفوتومتر اندازه گیری شد. مقدارترکیبات فنولیک برحسب میلی گرم در کیلوگرم نمونه روغن بر طبق فرمول (3-2) محاسبه گردید:
معادله (3-2):
در این فرمول Y مقدار ترکیبات فنولی نمونه بر حسب میلی گرم بر میلی لیتر و W وزن نمونه روغن است (کاپانسی و همکاران9،2000).
3-6-3- اندازه گیری ترکیبات فنولیک عصاره گیاه هلپه
میزان کل ترکیبات فنولی عصاره به روش فولین- سیوکالچو اندازه گیری شد. در این روش معرف فولین در حضور ترکیبات فنولی در محلول قلیایی، احیا و رنگ آبی در محلول تولید میشود (کاپانسی و همکاران، 2000؛ جوانمردی و همکاران، 2003). در این روش مقدار 50 میکرولیتر از نمونه با 5/2 میلی لیتر معرف فولین سیوکالچو که به نسبت 1به 10 با آب مقطر رقیق شده بود، مخلوط گردید. سپس 2 میلی لیتر سدیم کربنات (5/7 درصد وزنی حجمی) به آن اضافه شد. سپس به مدت 15 دقیقه در دمای 45 درجه سانتی گراد انکوبیت شد تا فاز آبی گسترش یابد و سپس جذب آن در 765 نانومتر توسط اسپکتروفتومتریUV -Vis خوانده شد. از روی شیب نمونه استاندارد اسید گالیک، که از شکل 3-2 بدست آمد، مقدار کل ترکیبات فنولیک بر مبنای میلی گرم اسید گالیک موجود در کیلوگرم عصاره گزارش گردید.

3-7- اندازهگیری ترکیبات توکوفرولی
3-7-1- ترسیم منحنی کالیبراسیون
ابتدا محلولهای استاندارد صفر تا240 میکروگرم آلفا- توکوفرول در میلیلیتر تولوئن تهیه شد. یک میلیلیتر از این محلولها به بالن ژوژه 10 میلی لیتر اضافه شد. پنج میلیلیتر تولوئن به هر محلول اضافه و بخوبی مخلوط شد. سپس 5/3 میلی لیترمحلول 2،2′- بی پیریدین (07/0 درصد وزنی حجمی دراتانول آبی 95 درصد) و 5/0 میلیلیترکلرید آهن ? شش آبه ( 2/0 درصد وزنی حجمی در اتانول آبی 95 درصد) اضافه و مخلوط گردید. سرانجام، حجم محلولهای استاندارد با اتانول آبی95 درصد به 10 میلیلیتر رسانده شد. محلول حاصل به مدت یک دقیقه درحال سکون قرارگرفت وجذب آن در520 نانومتر خوانده شد. سپس شکل 3-3 که منحنی کالیبراسیون غلظت آلفا- توکوفرول در برابر جذب خوانده شده بود، ترسیم شد.

شکل 3-3- منحنی کالیبراسیون میزان آلفا- توکوفرول در برابر میزان جذب خوانده شده در طول موج 520 نانومتر

3-7-2- اندازهگیری ترکیبات توکوفرولی نمونه روغن بدون آنتیاکسیدان
در این آزمون 190 تا 210 میلی گرم نمونه روغن بدقت داخل بالن ژوژه10میلی لیتری وزن شد. پنج میلیلیتر تولوئن به نمونه اضافه و بخوبی مخلوط شد. سپس 5/3 میلی لیتر محلول 2،2′- بیپیریدین (07/0 درصد وزنی حجمی در اتانول آبی 95 درصد) و 5/0میلیلیتر کلریدآهن ? شش آبه (2/0درصد وزنی حجمی در اتانول آبی 95 درصد) اضافه و مخلوط گردید. سرانجام، حجم محلولهای استاندارد با اتانول آبی 95 درصد به10میلیلیتر رسانده شد. محلول حاصل به مدت یک دقیقه در حال سکون قرار گرفت و جذب آن در 520 نانومتر خوانده شد. مقدار ترکیبات توکوفرولی براساس میلیگرم در کیلوگرم روغن بر طبق فرمول (3-3) محاسبه گردید:
معادله (3-3):
در این فرمول A و B به ترتیب میزان جذب نمونه و شاهد (دقیقا محلول تهیه شده بجز روغن)، M شیب منحنی استاندارد میزان جذب در برابر غلظت آلفا- توکوفرول، W وزن نمونه بر حسب گرم و T غلظت توکوفرول بر حسب میلی گرم در کیلوگرم روغن است است. مقدار M در این آزمایش 0039/0 با ضریب تبیین 99/0 تعیین شد (ونگ و همکاران، 1988).

3-7-3- اندازهگیری ترکیبات توکوفرولی عصاره گیاه هلپه
میزان کل ترکیبات توکوفرولی عصاره بر مبنای – توکوفرول اندازهگیری شد. در این آزمون، 100میلیگرم عصاره بدقت داخل بالن ژوژه10میلیلیتری وزن شد. 5 میلیلیتر تولوئن به نمونه اضافه و بخوبی مخلوط شد. سپس 5/3 میلیلیتری محلول 2 و 2? بی پیریدین (07/0 درصد وزنی حجمی در اتانول آبی 95 درصد) و 5/0 میلیلیتر کلرید آهن ? شش آبه (2/0 درصد وزنی حجمی در اتانول آبی 95 درصد) اضافه ومخلوط گردید. سرانجام، حجم محلولهای استاندارد با اتانول آبی 95 درصد به10میلیلیتر رسانده شد. محلول حاصل به مدت یک دقیقه درحال سکون قرارگرفت وجذب آن در 520 نانومتر توسط اسپکتروفتومتریUV-Vis خوانده شد. مقدارترکیبات توکوفرولی براساس میلیگرم در کیلوگرم نمونه با توجه به شیب نمونه استاندارد – توکوفرول، که در شکل (3-3) بدست آمد گزارش شد (ونگ و همکاران، 1998).
3-8- بررسی فعالیت آنتی اکسید
انی عصاره
3-8-1- آزمون حذف رادیکال های آزاد DPPH
آزمایش مهار رادیکال آزاد برای اولین بار به وسیله ی بلویس در سال 1958 و بعد از کمی اصلاح به وسیله تحقیقات بی شماری به شکل کنونی انجام می شود. این آزمایش بر اساس مهار DPPH که با اضافه کردن گونه های رادیکالی یا آنتی اکسیدان باعث بی رنگ شدن محلول DPPH می شوند، تعیین می گردد. توانایی دادن اتم هیدروژن یا الکترون توسط ترکیبات عصاره های مختلف در تست با میزان بی رنگ کردن محلول بنفش 2 و 2 دی فنیل-1- پیکریل هیدرازیل در متانول مورد سنجش قرار می گیرد. رادیکالهای آزاد موجودDPPH در 517 نانومتر جذب دارند که از قانون بیر لامبرت پیروی می کنند وکاهش جذب آن با میزان ماده آنتی اکسیدان رابطه خطی دارد، هر چه بر مقدار ماده آنتی اکسیدان افزوده شود DPPH بیشتری مصرف شده و رنگ بنفش بیشتر به سمت بی رنگ شدن میل می کند. در این تحقیق به عنوان ترکیب رادیکالی پایدار از DPPH به عنوان معرف استفاده شد، بدین ترتیب که 50 میکرولیتر از عصاره های مختلف، با غلظت 200 میکروگرم در سی سی به 5 میلی لیتر محلول 004/0 درصد DPPH در متانول اضافه گردید و به شدت هم زده شد، بعد از 30 دقیقه گرمخانه گذاری در دمای معمولی اتاق و مکانی تاریک، جذب نوری نمونه ها در طول موج nm 517 مقابل شاهد خوانده شد (بوریتس و همکاران10، 2000).
درصد مهار رادیکال آزاد DPPH با استفاده از فرمول زیر محاسبه می گردد:

در این فرمول Ablank جذب نوری شاهد را که فاقد عصاره می باشد نشان می دهد و Asample میزان جذب نوری غلظتهای مختلف عصاره را بیان می کند.
در این تست توانائی دادن اتم هیدروژن یا الکترون توسط ترکیبات و عصاره های مختلف با میزان بی رنگ کردن محلول بنفش 2و2- دی فنیل-1- پیکریل هیدرازین (DPPH) در حلال های اتانول- آب، اتانول، آب مورد سنجش قرار گرفت.

3-8-2- آزمون بتاکاروتن – لینولئیک اسید
اساس این روش بی رنگ شدن بتاکاروتن است که مکانیسم آن، واکنش بتا کاروتن با رادیکال آزاد تولید شده در نتیجه تشکیل هیدروپراکسید از لینولئیک اسید می باشد. برای انجام آزمایش ابتدا یک محلول پایه از بتاکاروتن- لینولئیک اسید به صورت زیر تهیه گردید:
نیم میلی گرم بتاکاروتن در 1 میلی لیتر کلروفرم حل شد و سپس 25 میکرولیتر لینولئیک اسید و 200 میلی گرم توئین 40 به آن اضافه گردید و کاملاً مخلوط شد. سپس با روش تبخیر در خلاء، کلروفرم جدا گردیده و 100 میلی لیتر آب مقطر اشباع شده از اکسیژن (30 دقیقه تحت فشار 100 میلی لیتر در دقیقه) همراه با تکان شدید به آن اضافه شد. 5/2 میلی لیتر از محلول تهیه شده فوق به لوله آزمایش منتقل شد و 350 میکرولیتر از عصاره (غلظت 2 گرم در لیتر در اتانول) به لوله آزمایش اضافه گردید. بعد از 48 ساعت گرمخانه گذاری در دمای اتاق، جذب نوری نمونه ها در 490 نانومتر خوانده شد و میزان فعالیت آنتی اکسیدانی، از مقایسه جذب نوری نمونه ها با زمان صفر و از روی میزان پایداری رنگ زرد بتاکاروتن به درصد مورد سنجش قرار گرفت ( داپکویکوس و همکاران11، 1998). ظرفیت آنتی اکسیدانی عصاره به عنوان درصد بازداری بیان می شود.
درصد مهار آزمون بتا کاروتن با استفاده از فرمول زیر محاسبه می گردد:

Ac (0) = جذب خوانده شده برای شاهد در زمان صفر، Ac (48) = جذب خوانده شده برای شاهد بعد از 48 ساعت، As (0) = جذب خوانده شده برای نمونه در زمان صفر، As (48) = جذب خوانده شده برای نمونه بعد از 48 ساعت می باشد.

شکل 3-4- دستگاه اسپکتروفتومتر

3-8-3- شاخص پایداری اکسایشی(12OSI)
برای تعیین پایداری اکسایشی، ppm 200 عصاره گیاه هلپه به روغن کانولا بدون آنتی اکسیدان اضافه گردید. پایداری اکسایشی توسط دستگاه رنسیمت مدل 743 ، تحت شرایط دمایی 120 درجه سانتی گراد و سرعت جریان هوا 20 لیتر در ساعت انجام گرفت (فرهوش، 2007).

شکل 3- 5- دستگاه رنسیمت مدل 743
3-9- آزمون پایداری روغن
3-9-1 شرایط حرارت دهی
سه عصاره استخراج شده با سه حلال فوق (آب، اتانول و اتانول- آب) در غلظت ppm 200 به روغن کانولای بدون آنتی اکسیدان سنتتیک اضافه شد و سپس در سرخ کن به مدت 10 ساعت در هر روز (طی 3 روز متوالی) در دمای 180 درجه سانتی گراد حرارت دهی شد. نمونه برداری در فواصل زمانی 5 ساعت (0، 5، 10، 15، 20، 25 و 30) انجام شد. در پایان هر روز نمونه برداری، روغن باقی مانده در سرخ کن پس از خنک شدن نمونه ها در محیط و تزریق گاز ازت، بسته بندی شده و در دمای 18- درجه سانتیگراد در فریزر نگهداری شد.
در کلیه آزمایشات (شرایط حرارتی) نمونه ها با نمونه روغن کانولا که حاوی آنتی اکسیدان سنتتیک BHA به غلظت ppm 200 (نمونه شاهد) است مورد مقایسه قرار گرفتند.

3-9-2- اندیس اسیدی
عدد اسیدی توسط روش تیتراسیون و بر اساس میزان هیدروکسید پتاسیم مصرف شده محاسبه میشود. در این آزمون 10 گرم نمونه داخل ارلن مایر توزین شد و به آن50 میلی لیتر حلال اتانول – کلروفرم (50 : 50) اضافه گردید سپس آن را به خوبی تکان میدهیم تا روغن حل شود (حلال باید خنثی باشد زیرا در غیر اینصورت باعث افزایش یا کاهش خاصیت اسیدی می گردد) بعد نمونه در مجاورت معرف فنل فتالئین با پتاس 1/0 نرمال تا زمان ظهور رنگ صورتی تیتر شد. عدد اسیدی بر حسب پتاس مصرف شده برطبق معادله (3-4) محاسبه شد (AOCS, 1993).
معادله (3-4):
N = نرمالیته پتاس
V = حجم پتاس مصرفی
W = وزن نمونه
3-9-3- شاخص پایداری اکسایشی (OSI)
برای تعیین پایداری اکسایشی از دستگاه رنسیمت مدل 743 استفاده شد. برای این منظور، سه گرم نمونه روغن کانولا در دمای 120 درجه سانتیگراد مورد آز
مایش قرار گرفت. سرعت جریان هوا 15 لیتر بر ساعت بود (Farhoosh, 2007).
3-9-4- اندازگیری عدد پراکسید (PV)
3-9-4-1- ترسیم منحنی کالیبراسیون
محلولهای استاندارد آهن ? شامل یک تا 40 میکروگرم آهن ? در میلی لیتر تهیه شد. 1/0 میلی لیتر از محلولهای استاندارد را به 8/9 میلی لیتر مخلوط کلروفرم : متانول (به نسبت 7 : 3) اضافه شد و به مدت 2 تا 4 ثانیه همزده شد. سپس به ترتیب 50 میکرولیتر محلول تیوسیانات آمونیوم و محلول آهن ? اضافه و بعد از اضافه کردن هر کدام به مدت 2 تا 4 ثانیه محلول هم زده شد. پس از 5 دقیقه گرمخانه گذاری در دمای اتاق، میزان جذب نمونه در طول موج 500 نانومتر در برابر شاهد تعیین شد. تمامی مراحل انجام آزمایش زیر نور ملایم و به مدت 10 دقیقه صورت گرفت. سپس منحنی غلظت آهن ? در برابر میزان جذب خوانده شده در 500 نانومتر رسم شد (شکل 3- 6).

شکل3-6- منحنی کالیبراسیون غلظت آهن ? در برابر جذب خوانده شده درطول موج 500 نانومتر

3-9-4-2- تهیه محلول استاندارد آهن ?
برای این منظور، 5/0 گرم پودر آهن در 50 میلی لیتر اسید کلریدریک 10 نرمال حل و یک تا دو میلی لیتر محلول پراکسیدهیدروژن 30 درصد به آن اضافه شد. پراکسیدهیدروژن اضافی با جوشاندن به مدت 5 دقیقه حذف شد. محلول در دمای اتاق خنک و حجم آن با آب مقطر روی 500 میلی لیتر تنظیم گردید. 1 میلی لیتر از محلول حاصل با حلال کلروفرم : متانول (به نسبت 7 : 3) به حجم 100 میلی لیتر رسانده شد. محلولهای استاندارد از این محلول تهیه گردیدند.
3-9-4-3- تهیه محلول تیوسیانات آمونیوم
30 گرم تیوسیانات آمونیوم در آب حل شد و حجم آن به 100 میلی لیتر رسانده شد.

3-9-4-4- تهیه محلول آهن ?
ابتدا محلول کلریدباریم دو آبه را با اضافه کردن 5/0 گرم کلریدباریم دوآبه به 50 میلی لیترآب دیونیزه و محلول سولفات آهن هفت آبه را با اضافه کردن 5/0 گرم سولفات آهن هفت آبه به 50 میلی لیتر آب دیونیزه تهیه کردیم. سپس این دو محلول را با هم مخلوط کرده و 2 میلی لیتر اسید کلریدریک 10 نرمال به آن اضافه کردیم. که باعث ته نشین شدن سولفات باریم شد بعد از صاف کردن و خارج کردن سولفات باریم ته نشین شده، محلول صاف شده محلول آهن ? است که در بطری های تیره و به دور از نور محیط نگهداری شد.
3-9-4-5- عدد پراکسید نمونه روغن
در این آزمون بسته به میزان پراکسایش روغن، 1/0 تا 2/0گرم نمونه روغن حاوی عصاره در لوله های آزمایش 15 میلی لیتری وزن و به مدت 2 تا 4 ثانیه با 8/9 میلی لیتر حلال کلروفرم:متانول (به نسبت 3:7)همزده شد. سپس به ترتیب 50 میکرولیتر محلول تیوسیانات آمونیوم و محلول آهن ? اضافه و بعدازاضافه کردن هرکدام به مدت 2 تا 4 ثانیه هم زده شد و پس از 5 دقیقه گرمخانه گذاری در دمای اتاق، میزان جذب نمونه در طول موج 500 نانومتر تعیین شد. تمامی مراحل این آزمون زیر نور ملایم و به مدت دقیقه 10 انجام شد. عدد پراکسید از معادله (3- 5) محاسبه شد:
معادله (3-5):
As میزان جذب نمونه، Ab میزان جذب شاهد در طول موج 500 نانومتر، m شیب به دست آمده از منحنی کالیبراسیون (86/40 باضریب تبیین 99/0) و W وزن نمونه روغن است (شانتا و دکر، 1994).
3-9-5- اندازگیری عدد کربونیل
معرف 2 و 4- دی نیترو فنیل هیدرازین (DNPH) با انحلال 50 میلی گرم (DNPH) در 100 میلی لیتر حلال محتوی 5/3 میلی لیتر اسید کلریدیک غلیظ تهیه شد. سپس (04/0 تا 1/0 گرم) نمونه روغن در بالن حجمی 10 میلی لیتری با 2- پروپانول به حجم رسانده شد. سپس 1 میلی لیتر روغن در بالن حجمی 10 میلی لیتری با تری‌فنیل‌فسفین به منظور کاهش تشکیل هیدرو پراکسید به حجم رسانده شد. یک میلی لیتر از محلول فوق با یک میلی لیتر معرف 2 و 4- دی نیترو فنیل هیدرازین (DNPH) مخلوط و محلول به دست آمده به مدت 20 دقیقه در دمای 40 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. سپس در حمام یخ خنک شد. 8 میلی لیتر محلول هیدرواکسید پتاسیم 2 در صد به آن اضافه شد. سپس نمونه ها به مدت 5 دقیقه با سرعت g 2000 در دمای با محیط سانتریفوژ شد. میزان جذب آن در طول موج 420 در مقابل نمونه شاهد که همه مواد شیمیایی مورد نظر به جز استاندارد و نمونه مورد نظر را دارا بود قرائت شد. منحنی کالیبراسیون نیز رسم گردید. آلدئید استاندارد (2- 4 دکا دی انال) نیز در بالن های 10 میلی لیتری وزن و در غلظت های 50 تا 500 میکرو مولار تهیه گردید(Endo et al, 2001; Farhoosh & Moosavi, 2006). شیب منحنی استاندارد جذب در برابر غلظت آلدئید استاندارد در این آزمایش 001153/0 محاسبه شد. مقدار عدد کربونیل ازمعادله (3- 6) محاسبه شد:
معادله (3- 6):

A : میزان جذب نمونه روغن در طول موج 420 نانومتر
W : وزن نمونه به گرم
CV : عدد کربونیل براساس میکروگرم بر مول
M : شیب منحنی استاندارد (اندو و همکاران،2002؛ فرهوش و موسوی، 2006).
3-9-6- شاخص رنگی
برای اندازگیری شاخص رنگی از دستگاه اسپکتوفتومتر استفاده شد. جذب نمونه های روغن در طول موج 420 نانومتر در مقابل آب به عنوان شاهد اندازگیری شد (ساگوی و همکاران، 1996).
3-9-7- اندازگیری مقدار کل ترکیبات قطبی
3-9-7-1- آماده سازی سیلیکاژل
سیلیکاژل به مدت یک شبانه روز در دمای 160 درجه سانتی گراد خشک شد. سپس در همان حالت داغ به داخل ظرف شیشه ای ریخته شد و به نسبت مشخص با آب (95 : 5) مخلوط گردید و در ظرف شیشه ای به شدت هم زده شد تا از کلوخه ای شدن سیلکاژل جلوگیری شود. بعد از یک شبانه روز سیلیکاژل آماده مصرف می شود.
3-9-7-2- پر کردن ستون کروماتو گرافی
یک گرم سیلیکاژل آماده سازی شده به داخل ستون کروماتوگرافی (ستون پلاستیکی با ارتفاع 15 سانتیمتر)
که طرفین آن با پشم شیشه مسدود شده بود، ریخته شد. محتویات لوله کروماتوگرافی با میله شیشه ای متراکم گردید.
3-9-7-3- تهیه و آماده سازی نمونه وحلال جداسازی
5/0 گرم روغن در بالون ژوژه 5 میلی لیتری ریخته و با حلال تولوئن به حجم رسانده شد. یک میلی لیتر از این محلول با حفظ شرایط مناسب (استفاده از تهویه) در بالای ستون کروماتوگرافی ریخته شد. برای تهیه سیستم حلال، حلالهای ایزوهگزان (85) و دی ایزوپروپیل اتر (15) با هم مخلوط گردیدند.
3-9-7-4- عملیات کروماتوگرافی و محاسبه درصد ترکیبات قطبی کل
بعد از خیس خوردن نمونه در بالای ستون کروماتوگرافی و تبخیر تولوئن، به ترتیب طی 3 مرحله مقادیر معینی از حلال جدا سازی (1، 5/3 و 5/3 میلی لیتر) داخل ستون کروماتوگرافی انتقال یافت. پس از اتمام عملیات، انتهای ستون کروماتوگرافی با 500 میکرولیتر تولوئن شسته شد. تیخیر حلال با استفاده از قرار دادن نمونه در آون 50 درجه سانتی گراد انجام شد. میزان ترکیبات قطبی پس از تبخیر حلال توزین شد. درصد کل ترکیبات قطبی کل بر حسب طبق معادله (3-7) محاسبه گردید (شولت، 2004).

معادله (3-7):
Cp = درصد ترکیبات قطبی
Ws = وزن نمونه
Wn = وزن ترکیبات غیر قطبی
3-9-8- اندازهگیری عدد دیان مزدوج (کونژوگه)
نمونه روغن به نسبت 1 : 600 با هگزان نرمال (گرم به میلی لیتر) رقیق شد. سپس میزان جذب نمونه رقیق شده در طول موج 234 نانومتر خوانده شد. میزان جذب نمونه شاهد نیز با خواندن میزان جذب هگزان به دست آمد. مقدارترکیبات دیان مزدوج از معادله (3-8) محاسبه شد (ساگوی و همکاران، 1996).
معادله (3-8):
A = میزان جذب نمونه در طول موج 234 نانومتر
600 = رقت نمونه در هگزان
2900 = ضریب ثابت
3-9-9- اندازگیری عدد یدی
در این تحقیق عدد یدی به روش هانوس معرفی شده در روشهای AOAC شماره 920/158 تعیین گردید. در این آزمون 5/0 گرم روغن، 10 میلی لیتر کلروفرم و 25 میلی لیتر محلول هانوس داخل ارلن ریخته، آن را به آرامی هم زده و به مدت نیم ساعت در تاریکی قرار گرفت البته گاهی تکان داده شود. سپس 10 میلی لیتر یدید پتاسیم غیر اشباع اضافه گردید، ارلن را هم زده و 10 میلی لیتر آب مقطر و 1 میلی لیتر معرف چسب نشاسته اضافه شد و با تیوسولفات سدیم 1/0 نرمال تا بی رنگ شدن، عمل تیتراسیون انجام شد (Firestone, 1991). عدد یدی نیز از معادله (3-9) محاسبه شد.
معادله (3-9):
= N نرمالیته تیوسولفات سدیم
B= حجم محلول تیوسولفات سدیم مصرفی برای شاهد (بر حسب میلی لیتر)
S= حجم محلول تیوسولفات سدیم مصرفی برای نمونه (بر حسب میلی لیتر)
W= وزن نمونه (بر حسب گرم)
9/126 = جرم اتمی ید

3-10- تجزیه و تحلیل آماری
در این تحقیق اطلاعات به دست آمده به صورت طرح کاملاً تصادفی در قالب فاکتوریل در 3 تکرار انجام شد. داده های به دست آمده توسط نرم افزار SPSS آنالیز و میانگین ها در سطح 05/0 توسط آزمون دانکن مقایسه گردید. در نهایت نمودارها با نرم افزار Excel رسم شد.

فصل چهارم
نتایج

4-1- محتوای ترکیبات فنولیک عصارههای مختلف گیاه هلپه
میزان ترکیبات فنولیک در تیمارهای مختلف در جدول و شکل 4-1 آورده شده است. عصاره استخراج شده با حلال اتانول – آب به طور معنی داری بیشتر از مابقی تیمارها بودند (03/2±32/61 میلی‌گرم در گرم وزن خشک) (05/0>p).

جدول 4-1: میانگین مقدار فنول کل عصارهها با روش های مختلف عصاره گیری از گیاه Helpeh
روش عصاره گیری- حلال
میلی‌گرم در گرم وزن خشک
ماسراسیون (آب)
41/47±5/0 c
ماسراسیون (اتانول- آب)
32/61±03/2 a
ماسراسیون (اتانول)
05/56±64/1 b
*اعداد به صورت میانگین انحراف معیار (Mean±SD) دارای حروف مشترک از لحاظ آماری تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند.
*حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد میباشد.

شکل 4-1: مقایسه میانگین مقدار فنولیک عصارههای گیاه هلپه

4-2- مقدار توکوفرول به دست آمده از عصاره های گیاه هلپه
میزان ترکیبات توکوفرولی بدست آمده در تیمارهای مختلف در شکل و جدول 4-2 آورده شده است. با توجه به نتایج بدست آمده از آنالیز دادهها، مقدار ترکیبات توکوفرولی استخراج شده با حلال اتانول – آب بیشتر از سایر تیمار ها (ppm 87/2±58/95) میباشد ولی از لحاظ آماری با تیمارهای دیگر اختلاف معنی داری مشاهده نشد (05/0جدول 4-2: میانگین مقدار توکوفرول عصاره با روش های مختلف عصاره گیری از گیاه Helpeh
روش عصاره گیری- حلال
مقدار توکوفرول بر حسب ppm
ماسراسیون (آب)
08/94±61/2a
ماسراسیون (اتانول- آب)
58/95±87/2 a
ماسراسیون (اتانول)
17/89±62/3 a
*اعداد به صورت میانگین انحراف معیار (Mean±SD) دارای حروف مشترک از لحاظ آماری تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند.
*حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد میباشد.

شکل 4-2: مقایسه میانگین مقدار ترکیبات توکوفرولی عصارههای گیاه هلپه

4-3- نتایج به دست آمده برای فعالیت آنتی اکسیدانی، طبق آزمون های مختلف برای عصاره های گیاه هلپه
4-3-1- نتایج آزمون درصد مهار رادیکال آزاد DPPH برای عصاره های مختلف گیاه هلپه
مقادیر عددی درصد مهار رادیکال آزاد DPPH در تیمارهای مختلف در جدول و شکل 4-3 نشان داده شد. در این آزمون بیشترین درصد
مهار مربوط به عصاره ماسراسیون اتانول – آب (19/47 %) و کمترین آن مربوط به دو عصاره ماسراسیون آب و اتانول (به ترتیب 13/30% و 81/33%) میباشد. در این آزمون درصد مهار عصاره اتانول – آب با دو عصاره اتانول و آب اختلاف معنی داری دارد (05/0>p) ولی دو عصاره آب و اتانول با یکدیگر اختلاف معنی داری ندارند (05/0جدول 4-3: میانگین درصد مهار رادیکال آزاد DPPH در عصاره های مختلف گیاه Helpeh
روش عصاره گیری- حلال
غلظت ppm200
ماسراسیون (آب)
13/30±78/3b
ماسراسیون (اتانول- آب)
19/47±71/2 a
ماسراسیون (اتانول)
81/33±16/3 b
*اعداد به صورت میانگین انحراف معیار (Mean±SD) دارای حروف مشترک از لحاظ آماری تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند.
*حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد میباشد.

شکل 4-3: مقایسه میانگین درصد مهار رادیکال آزاد DPPH در عصاره های مختلف گیاه هلپه در غلظت ppm 200

4-3-2- نتایج آزمون بی رنگ شدن بتاکاروتن – لینولئیک اسید برای عصاره های مختلف گیاه هلپه
مقادیر عددی آزمون بتاکاروتن در تیمارهای مختلف در جدول و شکل 4-4 آورده شده است. عصاره استخراج شده با حلال اتانول – آب دارای بیشترین درصد بازداری (5/33%) میباشد که با سایر عصارهها اختلاف معنی داری دارد (05/0>p). کمترین درصد مهار نیر در دو عصاره آب و اتانول مشاهده شد (به ترتیب 39/21 و 01/24) که از لحاظ آماری باهم اختلاف معنی دار ندارند (05/0روش عصاره گیری- حلال
غلظت ppm200
ماسراسیون (آب)
39/21±69/2b
ماسراسیون (اتانول- آب)
50/33±92/1 a
ماسراسیون (اتانول)
01/24±24/2 b
*اعداد به صورت میانگین انحراف معیار (Mean±SD) دارای حروف مشترک از لحاظ آماری تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند.
*حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد میباشد.

شکل 4-4: مقایسه میانگین درصد بی رنگ شدن بتاکاروتن در عصاره های مختلف گیاه هلپه در غلظت ppm 200

4-3-3- نتایج آزمون شاخص پایداری اکسایشی (OSI) در دمای 120 درجه سانتیگراد و غلظت ppm 200 از عصاره های گیاه هلپه و ppm 200 آنتیاکسیدان سنتتیک BHA افزوده شده به روغن کانولا
مقادیر شاخص پایداری اکسایشی بر حسب ساعت در تیمارهای مختلف در جدول و شکل 4-5 آورده شده است. با توجه به نتایج بدست آمده تیمار حاوی آنتی اکسیدان سنتزی BHA با سایر تیمارها اختلاف معنی داری دارد (08/5) (05/0>p) اما سایر تیمارها با یکدیگر اختلاف معنی دار نداشتند (05/0روش عصاره گیری- حلال
شاخص پایداری اکسایشی برحسب ساعت
ماسراسیون (آب)
72/2±10/0b
ماسراسیون (اتانول- آب)
91/2±10/0b
ماسراسیون (اتانول)
77/2±10/0b
BHA
08/5± 22/0a
*اعداد به صورت میانگین انحراف معیار (Mean±SD) دارای حروف مشترک از لحاظ آماری تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند.
*حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد میباشد.

شکل 4-5: مقایسه میانگین شاخص پایداری اکسایشی در عصاره های مختلف گیاه هلپه در غلظت ppm 200

4-4- بررسی خاصیت آنتیاکسیدانی عصارههای گیاه هلپه با غلظت ppm 200 در روغن کانولا
سه عصاره استخراج شده با سه حلال (آب، اتانول و اتانول- آب) در غلظت ppm 200 به روغن کانولای بدون آنتی اکسیدان سنتتیک جهت تعیین فعالیت آنتیاکسیدانی عصاره گیاه هلپه اضافه شد. فرایند حرارت دهی به مدت 30 ساعت در دمای 180 درجه سانتی گراد انجام شد. مقدار شاخصهای پایداری اکسایشی روغن، عدد پراکسید، عدد کربونیل، عدد یدی، ترکیبات قطبی، عدد اسیدی، شاخص رنگی و ترکیبات فنولی در فواصل زمانی 5 ساعت (0، 5، 10، 15، 20، 25 و 30) مورد بررسی قرار گرفت.
در کلیه آزمایشات (شرایط حرارتی) نمونهها با نمونه روغن کانولا که حاوی آنتیاکسیدان سنتتیک BHA به غلظت ppm 200 (نمونه شاهد) است مورد مقایسه قرار گرفتند.
4-4-1- تغییرات عدد اسیدی طی فرآیند حرارت دهی در دمای 180 درجه سانتیگراد
نتایج مربوط به مقادیر عدد اسیدی در طی فرآیند حرارتی در جدول و شکل 4-6 آورده شده است. نتایج آنالیز آماری نشان داد که اثر متقابل معنیدار بین زمان و تیمارها وجود دارد. به طور کلی تغییرات عدد اسیدی نشان داد که در طول زمان حرارت دهی، اکثر تیمارها با تغییرات معنیداری (05/0>p) همراه بود با افزایش زمان میزان عدد اسیدی افزایش یافت. مقایسه میزان عدد اسیدی در تیمارهای مختلف در زمانهای مختلف حرارت دهی حاکی از آن بود که نمونه حاوی آنتیاکسیدان BHA در تمامی زمان ها دارای کمترین عدد اسیدی میباشد. نمونه حاوی عصاره استخراج شده با آب و اتانول در طول زمانهای حرارت دهی بجز زمان صفر به طور معنی دار دارای بیشترین مقدار عدد اسیدی میباشند (05/0p).

جدول4-6: میانگین تغییرات عدد اسیدی در عصارههای مختلف در غلظت ppm 200 طی دوره حرارت دهی
نوع عصاره
زمان حرارت دهی (ساعت)

0
5
10
15
20
25
30
آب
104/0±0/0fg
177/0±06/0ef
177/0±06/0ef
248/0±06/0e
355/0±06/0d
674/0±06/0b
923/0±06/0a
اتانول-آب
131/0±05/0fg
096/0±0/0fg
126/0±05/0fg
131/0±05/0fg
137/0±06/0fg
254/0±06/0e
585/0±04/0c
اتانول
099/0±0/0fg
169/0±05/0ef
169/0±05/0ef
236/0±05/0e
33/0±05/0d
64/0±05/0bc
878/0±05/0a
BHA
09/0±039/0fg
065/0±0/0g
085/0±036/0fg
088/0±038/0fg
092/0±039/0fg
17/0±042/0ef
39/0±031/0 d
*اعداد به صورت میانگین انحراف معیار (Mean±SD) دارای حروف مشترک از لحاظ آماری تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند.
*حرو
ف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد میباشد.

شکل 4-6: مقایسه میانگین تغییرات عدد اسیدی عصارههای مختلف در غلظت ppm 200 در روغن کانولا طی دوره حرارت دهی

4-4-2- تغییرات عدد پراکسید طی فرآیند حرارت دهی در دمای 180 درجه سانتیگراد
نتایج مربوط به مقادیر عددی پراکسید در طی فرآیند حرارتی در جدول و شکل 4-7 آورده شده است. نتایج بدست آمده از آنالیز دادهها نشان میدهد که نمونههای حاوی سه عصاره حلالی و BHA از لحاظ آماری از زمان صفر تا 20 ساعت اختلاف معنیداری با یگدیکر ندارند. به طور کلی تغییرات در عدد پراکسید نشان داد که از زمان 20 تا 30 ساعت نمونه حاوی دو عصاره آب و اتانول به طور معنی داری افزایش یافت (05/0p). اما تغییرات عدد پراکسید دو تیمار BHA و اتانول – آب تا 25 ساعت با یکدیگر اختلاف معنی داری نداشت (05/0p).

جدول4-7: میانگین تغییرات عدد پراکسید در عصارههای مختلف در غلظت ppm 200 طی دوره حرارت دهی
نوع عصاره
زمان حرارت دهی (ساعت)

0
5
10
15
20
25
30
آب
590/0±14/0 d
663/0±16/0 d
718/0±17/0 d
732/0±17/0 d
920/0±22/0 d
08/3±72/0bc
81/5±41/1a
اتانول-آب
554/0±13/0 d
560/0±13/0 d
627/0±155/0 d
649/0±160/0d
580/0±138/0d
795/0±18/0d
79/3±92/0b
اتانول
56/0±13/0 d
63/0±15/0 d
68/0±169/0 d
69/0±16/0 d
875/0±21/0d
93/2±69/0 c
53/5±34/1a
BHA
38/0±09/0 d
37/0±09/0 d
42/0±104/0 d
43/0±108/0 d
39/0±09/0 d
53/0±12/0 d
55/2±62/0 c
*اعداد به صورت میانگین انحراف معیار (Mean±SD) دارای حروف مشترک از لحاظ آماری تفاوت معنی داری با یکدیگر ندارند.
*حروف غیرمشابه بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 5 درصد میباشد.

شکل 4-7: مقایسه میانگین تغییرات عدد پراکسید عصارههای مختلف در غلظت ppm 200 در روغن کانولا طی دوره حرارت دهی

4-4-3- تغییرات عدد یدی طی فرآیند حرارت دهی در دمای 180 درجه سانتیگراد
نتایج مربوط به مقادیر عدد یدی در طی فرآیند حرارتی در جدول و شکل 4-8 نشان داده شد. نتایج مربوط به تغییرات عدد یدی در نمونه حاوی BHA در طی 30 ساعت حرارت دهی دارای کمترین مقدار بود و از لحاظ آماری اختلاف معنی داری با سایر تیمارها داشت (05/0p). همچنین مقدار عدد یدی نمونههای حاوی سه عصاره اتانول – آب، اتانول و آب در 30 ساعت حرارت دهی ابتدا افزایش و سپس کاهش یافت که از لحاظ آماری با یکدیگر اختلاف معنی داری نداشتند (05/0p).

جدول4-8: میانگین تغییرات عدد یدی در عصارههای مختلف در غلظت ppm 200 طی دوره حرار

دیدگاهتان را بنویسید